蛋白质控(Tyco)和微量热涌动(MST)操作规程

时间:2023-12-19浏览:254


一、开机

1、打开 Monolith 设备(开关在机器后面板左下侧);

2、打开电脑,启动 MO. Control 软件。


二、实验操作

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2、实验命名并保存;

3、选择荧光通道(BLUE/RED);

4、选择实验类型:

1):Pretest:主要是用于检测荧光分子的荧光强度、样品粘附以及聚集情况;

2):Binding Check:检测荧光分子中加或者不加配体分子后的信噪比,从而初步检测两分子是否有相互作用;

3):Binding Affinity:主要用于测定两个分子相互作用的亲和力(以平衡解离常数 Kd 值表示),这也是 MST 实验最常用的功能 ;

4):Expert Mode:若您已经熟练掌握 MST 实验以及操作软件以后,您可以使用该模式对实验进行更灵活的专家模式设置 ;

5、数据分析;

6、关机。


三、预实验(Pertest

1、实验计划( Plan Your Experiment

ATarget

1)命名 Target(荧光分子),默认为“MyTarget”

2)输入荧光分子的储存浓度(工作浓度的 2

);

B: 描述实验所用 Buffer

C:选择实验所用毛细管 ;

D:系统设定:

1Excitation Power 设为“auto-detect”,或者手动设置 Excitation Power 使得荧光分子的荧光值>3000for NT.115 Pico)或 300for NT. 115

2MST Power 使用默认设置即可(Medium);

E:点击“Go to Instructions”按钮;

2Instructions

A:按照 Instructions 上的要求准备样品 ;

B:用 2 个毛细管加载不同浓度的荧光分子并放置在样品托上(高浓度的放在 1 号),打开仪器放入样品托;

C:点击“Start Measurement”按钮 ;

3Result

A:查看 Capillary Scan 以了解荧光分子的荧光强度、粘附情况和均一性;

B:查看 MST 曲线以了解是否存在样品聚集;

C:点击“Review”按钮查看更多信息 。


四、Binding Check(可选)或 Binding Affinity Experiment

1Plan Your Experiment

ATarget

1)命名 Target(荧光分子),默认为“MyTarget”

2)输入荧光分子的储存浓度(工作浓度的 2

);

3)软件将根据检测器类型自动计算荧光分子的建议工作浓度。也可以通过点击铅笔符号进行人工输入 ;

B:描述实验所用 Buffer

C:选择实验所用毛细管类型 ;

D:系统设定 :

1)选择 Excitation Power(自动选择或者手动设定);

2)选择 MST Power(默认为 Medium);

ELigand(配体分子):

1)命名配体分子,默认为“MyLigand”

2)预估 Kd 值(可选);

3)输入非标记分子(Ligand)的储存浓度(起始工作浓度的 2

);

4)配体分子

比稀释的起始浓度为储存浓度的 1/2,一般起始浓度应大于 Kd 值的 50

以上,如果 Kd 未知,应选用较高浓度作为起始浓度。可以点击铅笔符号人工输入配体浓度 ;

5)点击“Go to Instructions”按钮进入下一步;

2Instructions

A:按照 Instructions 提示准备样品;

B:将配制好的样品加载入毛细管并放置在样品托上(注意手不能碰触毛细

管中间部位),打开仪器放入样品托;

C:点击“Start Measurement”按钮进行下一步测试 ;

3Result

A:查看 Capillary Scan 以了解荧光分子的荧光强度、粘附情况和均一性,查看 MST 曲线以了解是否存在样品聚集;

B:查看 Dose response 以了解信噪比;

C:点击“Review”查查看更多信息。