一、样品：
1、蛋白：浓度一般需大于200 ug/ml，要有活性，确保不含Tris、叠氮化纳等带有伯氨基团成分；
2、小分子：母液浓度建议大于10mM，体积50uL以上，纯度>90%，溶于100%DMSO里。如含有咪哗、蔗糖、甘油等高折光率物质，需进行脱盐处理。
二、开机：
1、启动电脑和仪器，Biacore X100 Plus的电源开关位于仪器右后侧下方。待主机面版上 TEMP 指示灯停止闪烁，即表示温度已稳定；
2、启动 Biacore X100 Control Software，登入；
3、待软件和主机建立连接，约 30 秒；
4、确认左侧缓冲液瓶已装入新鲜缓冲液且两根缓冲液管均插入瓶中；
5、确认右侧废液管已插入废液瓶中。
三、芯片的放置：
1、打开芯片室的门；
2、点击 Undock Chip 按钮，弹出对话框；
3、拉开芯片槽导轨，取出旧芯片 ；
4、把新芯片按箭头朝内方向插入，放平，推入芯片槽导轨；
5、点击对话框内的 Dock Chip 按钮；
6、确认缓冲液瓶中有足够的溶液；
7、点击 Tools—〉Prime，用缓冲液润洗整个管道系统。
四、样品的放取：
1、点击 Load Samples 图标；
2、待 Rack Locked 指示灯熄灭后，将样品盘轻轻提起取出；
3、将样品放入正确的位置：1-15 号可放置 1.5ml 标准 EP 管（必须剪去盖子，为防止溶液挥发，可加上 Biacore 专配的橡皮塞）；H2O处放置专配的 4ml塑料管，每次实验前加入去离子水（切勿加盖），用于清洗进样针。
4、放回样品盘，点击 OK。
五、配体偶联：
1、配体预富集：蛋白用醋酸钠pH5.5，5.0，4.5，4.0分别稀释到10 ug/ml，各准备100ul通过预富集实验确定最适宜 pH条件；
2、配体偶联：点击 Other Options，在弹出的选项卡中选择 Wizards，打开预设实验模板。在 Open/New Wizard Template 的左边目标栏里点中 Immobilization 后双击打开。对话框中，在Chip type中选CM5，勾选Flow cell 2；method选用amine氨基偶联，ligand输入配体名称。可选用Aim for Immobilized level，Target level输入计算出的偶联量，或选用specify contact timeand flow rate，输入偶联时间。接着按Next，勾选prime。然后按照仪器给出的样品位置和样品量放置相应试剂和样品，点击Start。
六、样品检测：
1、配置运行缓冲液和溶剂校正曲线
小分子样品的运行缓冲液选用含 5%DMSO 的 1×PBS-P+（视样品溶解性可调整 DMSO 含量，最高不超过 10%）
取 1.05 mL 10×PBS-P+用去离子水稀释到 1L，配成 1.05×PBS-P+。并按照下表，加入 DMSO，配置 5%DMSO 运行缓冲液和 4.5%、5.8%溶剂校正母液（running buffer 中 DMSO 浓度并非绝对 5%，可视小分子样品溶解度情况而定，0-10%均可。若 running buffer 中 DMSO 浓度变化，则溶剂校正母液也相应变化，只要 cover running buffer 中 DMSO 浓度即可）。
按照下表混合 4.5%和 5.8%母液配置 5%DMSO 浓度校正曲线（DMSO 标准液的数量并非一定要 8 个，通常 4-8 个均可。总体积也并非一定要 1.4ml，这些均可根据实际情况自行调整）
2、小分子样品准备
用不含 DMSO 的1.05×PBS-P+缓冲液稀释 10 mM 小分子母液 20
，得到 500 μM 含 5%DMSO 的1×PBS-P+中的小分子，再用配好的含 5% DMSO 的 Running Buffer 将分析物浓度稀释到 100 uM 作为最高进样浓度，向下对半稀释至少 5个浓度梯度，例如 100 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM（根据实际样品亲和力强弱进行浓度梯度调整）。间隔设置一个重复浓度，增加一个 0 浓度。
3、程序设置
（1）在Open/New Wizard Template 的左边目标栏里点中 Custom Assay Wizard 后双击打开。在 Custom Assay Wizard-System Preparation 界面，Flow cell 选择 1，2，同时勾选 Reference substration，Chip type 选择 CM5，Evaluation purpose 选择Kinetics/Affnity，将 prime before run 前的“√”去掉，点击 Next；
（2）在Cycle Definition 界面，点击 Cycle types 右侧的 new，新增一个循环，并点击Rename将分别将其命名为solvent correction 与analyte。选中Cycle types中的solvent correction 后，在左下方 Available 选项框中点击 Solvent correction，点击中间 Add 六次，增加六个溶剂矫正命令；
（3）选中Cycle types 中的 analyte 循环后，在左下方 Available 选项框中点击Sample，点击中间 Add，增加一个分析命令。点击 Selected 选项卡中的Sample1，在其右侧可以修改结合解离时间、流速等进样参数。本实验样品Contact time 修改为 60s， Dissociation time 为 120s，小分子通常无需再生。其他项无需修改。勾选 Extra wash，Extra wash 用 50% DMSO 清除管路中残留的小分子（extra wash 不流经芯片表面，不会影响配体活性）。点击两次Next；
（4）在Sample Table 界面，Concentration unit 选择 µM，点击 Add Row 增加循环。前三个循环 Cycle Type 为 analyte，Cycle purpose 为 Startup，Solution
称填入 PBS-P+。在实验浓度前后选择加入两个循环的溶剂校正Cycle Type与Cycle purpose 均选择 solvent correction。实验浓度部分 Cycle Type 为 analyte, Cycle purpose 为 Sample，Solution 填写样品名称，Conc 填写进样浓度（样品浓度由低到高填写）。注意要设置重复浓度和零浓度。具体填写如下：
（5）点击 Next 进入 Kinetics/Affinity-Rack Position 界面，保持默认位置或自行通过鼠标拖拽到指定位置。若要合并相同样品，点开 Menu 后选 Automatic Positioning，pooling 选项选择 yes，点击 OK；
（6）点击 Load Samples，取出样品架，按照屏幕显示准备相应样品，放入样品体积略大于显示体积即可。盖好橡胶盖防止挥发，并按指定位置放置。放入样品架，点 Next 后，对方法进行保存，再对数据进行保存。点击start，仪器便会开始自动运行。
七、实验结果分析
1、打开分析软件 Biacore X100 Evaluation Software，点Data中open打开文件；
2、先点solvent correction进行溶剂校正分析。曲线要求落在-500到+1000RU，Chi2小于2；
3、小分子因亲和力较弱，多数没有动力学曲线，因此常选用用Afinity拟合。亲和力较强有动力学曲线的小分子可选用 kineties模型拟合；
4、选择要分析的样品，点Next，在included curves可以选择待分析的样品浓度；
5、点击左上角Fit可得到拟合结果，得知小分了与蛋白的亲和力。
